ゾヌリン系09

http://physrev.physiology.org/content/91/1/151.long#sec-7

III-D. Zonulin Functional Characterization
ゾヌリンの機能的特長




Since no biological function has ever been described for pre-HP2, several experiments were performed to confirm its identity as zonulin.
これまでプレハプトグロビン2の生物学的機能が述べられてきたことはなかったので、ゾヌリンとしての独自性を確認するためにいくつかの実験が行われた。

Pre-Hp-2 gene was cloned in an inset vector system and expressed using a Baculovirus expression system.
プレハプトグロビン2の遺伝子を挿入ベクター系でクローニングし、バキュロウイルス発現系を使い発現させた。

The protein was recognized by the zonulin cross-reacting anti-Zot antibodies and was cleaved both by trypsin (159) and Caco2-derived trypsin into its α- and β-chains at the predicted Arg161 cleavage site (Fig. 4).
発現タンパク質は、抗Zot抗体のゾヌリン交差反応により認識され、トリプシンとCaco-2細胞由来トリプシンによりアルギニン161の予測開裂部位でα鎖とβ鎖に限定分解された(Fig.4参照)。

※Caco-2: ヒト結腸癌由来の細胞株

Since we have reported previously that the key biological effect of zonulin is to affect the integrity of intercellular TJ, we specifically focused our efforts on demonstrating that the recombinant pre-HP2 alters intestinal permeability.
以前にゾヌリンの重要な生物学的効果が細胞間タイトジャンクションの完全性に影響を与えることであると報告して以来、我々は組み換えプレハプトグロビン2が腸の透過性を変えるかを明らかにするための努力に特に集中した。

Indeed, ex vivo experiments showed that recombinant pre-HP2 induced a time- and dose-dependent reduction in TEER when added to murine small intestinal mucosa (159).
そしてまさしく、体外実験においてマウスの小腸粘膜に組み替えプレハプトグロビン2を加えると、時間と濃度依存的に経上皮電気抵抗(TEER)の減少の誘導が観察された。

These results were validated independently in an in vivo intestinal permeability assay in which zonulin, but not its cleaved form, induced a significant and reversible increase in both gastroduodenal and small intestinal permeability (Fig. 5).
これらの結果は、体内での腸の粘膜透過性の分析において、独立して立証された。
開裂していない形態のゾヌリンは、胃十二指腸と小腸の両方で透過性を著しく、かつ可逆的に増大させたのである(Fig.5参照)。

The evidence that zonulin cleaved in its α- and β-subunits lost the permeating activity further supports the notion that pre-HP2 (alias, zonulin) and mature HP2 exert two different biological functions most likely related to the different folding of the protein in its cleaved or not cleaved form.
α、βサブユニットに開裂したゾヌリンが透過活性を失うというエビデンスは、次のような概念をさらに支持する。
つまり、プレハプトグロビン2(ゾヌリン)と成熟したハプトグロビン2が二つの異なる生物学的機能を発揮するのは、開裂しているかどうかで異なるタンパク質の折りたたみ方の違いが十中八九関係しているというものだ。

The importance of HP folding in dictating its structure and function was further supported by the finding that anti-Zot antibodies recognize α1-chain under denaturing conditions but fail to recognize nondenatured HP1 (159).
その構造と機能を規定するハプトグロビンの折りたたみの重要性は、変性したハプトグロビンα-1鎖を抗Zot抗体は認識するが、変性していないハプトグロビン1の認識に失敗するという発見によって、さらに支持された。

※dictate: 記述させる、(事・状況が)規定する、必然的に決める

Fig. 4.
Caco2-derived trypsin IV cleaves zonulin in its two subunits.
Caco-2細胞由来トリプシンIVは、ゾヌリンを2つのサブユニットに限定分解する。

※supernatant: 上澄み液、上清

Western immunoblotting of recombinant zonulin before (lane 1) and after (lanes 6-8) incubation on Caco-2 cells.
組み換えゾヌリンのウェスタンブロッティングによる検出。
Caco-2細胞上でのインキュベーション前(1列目)、後(6~8列目)

※incubation: 保温、細菌の培養

The intensity of the ~18-kDa band (identified by NH2-terminal sequencing as the a2 chain) increased after 120-min incubation in Caco2 cells.
18キロダルトン帯の強度(a2鎖として塩基配列決定したN端配列により(抗体結合で)同定された)は、Caco-2細胞のインキュベーション120分後に増加した。

Media (lanes 2 and 3) and bovine serum albumin (BSA; lanes 4 and 5) were also tested to confirm antibody specificity.
培養液(2、3列目)、牛血清アルブミン(BSA、4、5列目)も、抗体の特異性を確認するためにテストされた。

※medium: 培養液、培地。culture medium(培養基)



Fig. 5.
Effect of zonulin on gastrointestinal permeability in vivo.
生体内での胃十二指腸透過性におけるゾヌリンの影響。

Zonulin (closed bars) increases both small intestinal (A) and gastroduodenal (B) permeability compared with BSA-treated controls (open bars).
ゾヌリン[黒抜き棒グラフ]は、腸(グラフA)と、胃十二指腸(グラフB)での透過性を増大させた。
牛血清アルブミンで処置したコントロール群[白抜き棒グラフ]と比較。

※bar chart: 棒グラフ。closed■、open□、(left,right,vertical,horizontal)hatched(striped)、dotted(shaded)など

The differences in lacman ratio (small intestinal permeability) and sucrose fractional excretion (gastroduodenal permeability) are shown as percentage of change in permeability between the measurements on the challenge day and 3 days before challenge.
ラクツロース/マンニトール比(小腸透過性)と、ショ糖分画排泄率(胃十二指腸透過性)において、透過性の変化の割合で違いが示された。
チャレンジ日とチャレンジ3日前との間で比較。

※LacMan: Lactulose/Mannitol ratio(LMR)の略。二糖類のラクツロースと単糖類のマンニトールの比率。粘膜上皮は二糖類を能動輸送できず、かつ細胞間隙からは吸収されにくいために、粘膜傷害や透過性の指標として使うことができる

※sucrose fractional excretion: ショ糖の分画排泄率。ショ糖もブドウ糖から構成される二糖類

※challenge: 抗原や病原菌の投与。攻撃

Mature two-chain HP2 (dotted bars) caused no changes in either small intestinal or gastroduodenal permeability.
成熟した二本鎖のハプトグロビン2[薄色棒グラフ]は、小腸、胃十二指腸どちらとも、透過性に変化を引き起こさなかった。

The effect of zonulin was completely reversible, since both small intestinal (C) and gastroduodenal (D) permeability returned to prechallenge values within 48 h.
ゾヌリンの影響は、完全に可逆的だった。
小腸(グラフC)と、胃十二指腸(グラフD)の透過性は、48時間以内にチャレンジ前の値に戻っていた。

The differences in lacman or sucrose fractional excretion are shown as percentage of permeability change between the value of 2 days after the challenge and the challenge day.
ラクツロース/マンニトール比、もしくはスクロース分画排泄率において、透過性の変化の割合で違いが示された。
チャレンジ日とチャレンジ2日後との間で比較。

*Lacman P < 0.0024 compared with both BSA control and 2-chain HP2;
ラクツロース/マンニトール比におけるP値は0.0024未満で有意差が認められた。

**Sucrose P < 0.0049 compared with both BSA control and 2-chain HP2 (n = 10 for each group of treatment).
スクロース分画排泄率におけるP値は0.0049未満で有意差が認められた。
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by travelair4000ext | 2012-10-31 09:38 | 翻訳  

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