アルコールと樹状細胞03

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3147329/#__sec2title

MATERIALS AND METHODS
題材と方法




Antibodies and reagents.
抗体と試薬

Fluorescein isothiocyanate (FITC)-CD11c, phycoerythrin (PE)-CD11c, PE-T-cell receptor beta (PE-TCR-β), peridinin chlorophyll protein (PerCP)-CD8a, anti-mouse-FITC, anti-rabbit-FITC, PE-anti-41BB-L, PE-anti-B7DC, PE-anti-B7-H3, PE-anti-B7-H4, PE-anti-OX40L, PE-anti-ICOSL, and FITC-anti-CD86 were purchased from eBioscience (San Diego, CA).
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-CD11c、フィコエリスリン(PE)-CD11c、PE-T細胞レセプターベータ(PE-TCR-β)、ペリジニンクロロフィル蛋白質(PerCP)-CD8a、抗マウス-FITC、抗ウサギ-FITC、PE-抗41BB-L、PE-抗B7-DC、PE-抗B7-H3、PE-抗B7-H4、PE-抗OX40L、PE-抗ICOSL、FITC-抗CD86を、イーバイオサイエンス社(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。

※phycoerythrin: 紅藻に含まれる赤色の色素。phyco-「海藻」、erythro-「赤」

Ovalbumin (OVA), hen egg lysozyme (HEL), lipopolysaccharide (LPS), and rabbit anti-Ova (C 6534) were obtained from Sigma-Aldrich.
卵白アルブミン(OVA)、ニワトリリゾチーム(HEL)、リポ多糖(LPS)、ウサギ抗Ova(C 6534)を、シグマアルドリッチ社から入手した。

※hen egg lysozyme (HEL): ニワトリリゾチーム。ニワチリの卵白に含まれるタンパク質。T細胞、B細胞を刺激する抗原として使われる

OVA peptides 323-339 and 257-264 were purchased from GenScript (Piscataway, NJ).
卵白アルブミンペプチドの323-339残基と257-264残基は、ジェンスクリプト社(ニュージャージー州ピスカタウェイ)から購入した。

Medium for DCs and DO11 cell culture, known as clone food (CF), contained 25 mM HEPES-buffered RPMI supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% nonessential amino acids, 5 mg/ml gentamicin, 100 U/ml penicillin G, 2 mmol/liter glutamine, 5 × 10^-5 2-mercaptoethanol, 1 mmol/liter sodium pyruvate, and 100 mg/ml streptomycin, which were purchased from Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.(Walkersville, MD).
DCとDO11細胞培養の培養液、いわゆるクローンフード(CF)は、25マイクロモルのHEPESで緩衝されたRPMI培地で構成した。
他に加えたのは、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%の非必須アミノ酸、5ミリグラム/ミリリットルのゲンタマイシン、100ユニット/ミリリットルのペニシリンG、2ミリモル/リットルのグルタミン、5×10の-5乗の2-メルカプトエタノール、1ミリモル/リットルのピルビン酸ナトリウム、100ミリグラム/ミリリットルのストレプトマイシンである。
これらはケンブレックス社バイオサイエンス・ウォーカービル(メリーランド州ウォーカーズビル)から購入した。

※HEPES: ヘペス。生理的緩衝液に使用される物質。緩衝液とは、酸やアルカリを加えても水素イオン濃度(pH)が変化しにくい溶液のこと。動物の体液も緩衝液



Animals.
動物

Six-week-old female BALB/c (H2d), CBA/caj (H2k), CBA/j (H2k), and C57BL/6 (H2b) mice were obtained from Jackson or Harlan Laboratories.
6週齢のメスのマウスのBALB/c (H2d)、CBA/caj (H2k)、CBA/j (H2k)、C57BL/6 (H2b)を、ジャクソン研究所またはハーランラボラトリーズから取得した。

※H2d, H2k, H2b: マウスのMHC(H2)ハプロタイプ。語尾の1文字で由来を表す(bはC57BLのblack等)

Rag1KO OT-I mice were purchased from Taconic.
Rag1ノックアウトOT-Iマウスは、タコニック社から購入した。

※OT-I mice: OVA抗原の257-264の8残基(SIINFEKL: セリン-イソロイシン-イソロイシン-アスパラギン-フェニルアラニン-グルタミン酸-リシン-ロイシン)とMHCクラスIの複合体を特異的に認識するT細胞レセプター(TCR)を強制発現させたC57BL/6由来マウス。OT-IIは257-264とMHCクラスIIとの複合体を認識するCD4+T

All animal procedures were approved by the Life Span Animal Care and Use Committee.
全ての動物の処置は寿命動物実験委員会により認可された。



Ethanol feeding regimen.
エタノールの投与法

Six-week-old female BALB/c, CBA, and C57BL/6 mice were placed on a chronic ethanol diet (Bioserv liquid diet; Bioserv, Frenchtown, NJ) that was prepared according to the manufacturer's instructions as previously described (1).
6週齢のメスのマウス、BALB/c、CBA、C57BL/6を、慢性的エタノール食(バイオサーブ流動食、バイオサーブ社、ニュージャージー州フレンチタウン)に配置した。
それは以前記述したように製造業者の指示に従って調理された。

Mice were fed either liquid ethanol or an isocaloric control diet for 8 weeks.
マウスにエタノール流動食か同カロリーのコントロール食を8週間与えた。

The ethanol content in the diet was gradually increased from 1.25% (wt/vol) to 2.5% by the second week and to 3.75% by the third week.
食事中のエタノール含有量は、1.25%から、2週までに2.5%、3週までには3.75%へと徐々に増加させた。

Mice were injected with Flt3L plasmid to expand the DCs in vivo 12 days before sacrifice.
マウスを殺す12日前、生体内で樹状細胞を増殖させるためにFlt3L (Fms like tyrosine kinase 3 Ligand)プラスミドを注入した。



Generation of DCs.
DCの生成

To boost the number of DCs obtained from the spleen, mice were given hydrodynamic injections with 10 μg of Flt3L-encoding plasmid in 2 ml saline via the tail vein (twice), as previously described (13).
脾臓から得られるDCの数を増やすため、以前記述したのと同様に、10マイクログラムのFlt3Lをコードしたプラスミドを、2ミリリットルの生理的食塩水と共に、マウスの尾静脈からハイドロダイナミックインジェクション法で注入した(2回)。

※hydrodynamic injection: プラスミドベクター等をマウスの尾静脈から比較的大量(体重の10%相当)の緩衝液と共に短時間(5から7秒)で一気に注入する。肝臓に効率よく遺伝子を導入できる手法

The injections were performed 12 and 7 days prior to the end of the 8-week feeding period.
その注入は8週間の実験期間終了の12日前と7日前に実施した。

The animals were sacrificed at the 8th week.
マウスは8週間で殺した。

DCs were isolated from spleens by use of CD11c microbeads (Miltenyi Biotec) and a magnetic separator.
CD11cマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社)と磁気細胞分離システムを使い、脾臓からDCを分離した。

※CD11c: マウスのDCは全てCD11cを発現する

※microbeads and magnetic separator: ビオチンで標識した抗体と、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズにより、特定の抗原を発現した細胞だけを磁石で選別する手法

The purity of the Flt3L-induced CD11c+ population was >95% after each isolation process, as measured by flow cytometry.
フローサイトメトリーにより計測したところ、Flt3Lにより誘導されたCD11c陽性DCの分離プロセス後の純度は95%以上であった。



Alloreactivity assays.
アロ反応性の分析

Allostimulation assays were performed with negatively selected T cells isolated from C57BL/6 spleens by use of pan-T-cell purification microbeads (Miltenyi Biotec).
汎T細胞精製マイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社)を使い、ネガティブセレクションを受けたT細胞をC57BL/6マウスの脾臓から分離して、アロ刺激分析を実施した。

※pan-T-cell purification microbeads: 汎T細胞精製マイクロビーズ。ビオチンで磁気標識した他の細胞を除去するか、もしくはT細胞のCD25に対して磁気標識することで、T細胞を分離する

Stimulator DCs were isolated from the BALB/c or CBA/caj strain after 8 weeks of ethanol or isocaloric pair feeding following Flt3L expansion in the spleen.
刺激細胞であるDCは、8週間のエタノールか同カロリーのペアフィーディング後に、脾臓でFlt3Lにより増殖させて、BALB/c系またはCBA/ca系から分離した。

※stimulator: 刺激細胞。MHCクラスIIを提示してCD4+Tの増殖を刺激する

※pair feeding: ペアフィーディング。摂取量もしくは摂取カロリーを実験群とコントロール群で等しくする(少ない方に合わせる)ことで、カロリーの違いによる影響を排除する研究法

After isolation, 10^7 DCs were incubated with or without 200 ng/ml LPS overnight.
分離後、10の7乗個のDCを200ナノグラム/ミリリットルのLPSと一緒、もしくはLPS無しで、一晩インキュベートした。

※incubate: 培養、インキュベート。温度を一定に保ち、培養に最適な環境を維持すること

DCs were washed three times with serum-free medium and cocultured with various numbers of T cells for 3 days (for enzyme-linked immunosorbent assay [ELISAs]) or 6 days (for proliferation assays) at 37°C.
DCを血清フリーの培養液で3度洗浄し、様々なT細胞と3日間(ELISA用に)、もしくは6日間(増殖分析用に)、37度Cで共培養した。

For ELISAs and thymidine incorporation assays, 10^5 T cells were plated in 96-well round-bottom plates.
EILSAと、チミジン取り込みを指標とした増殖の分析用に、10の5乗個のT細胞を96穴丸底プレートに設置した。

For carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) assays, 10^6 T cells were plated in 24-well plates.
カルボキシ・フルオレセイン・スクシンイミジル・エステル(CFSE)分析用に、10の6乗個のT細胞を24穴プレートに設置した。

※CFSE: 脂溶性が強く細胞膜を通過し、細胞内エステラーゼの作用で蛍光を発する分子。細胞増殖の分析に用いられる



Antigen degradation assays.
抗原の分解の分析

OVA and green fluorescent protein (GFP)(Millipore, Temecula, CA) degradation was measured by two different methods.
卵白アルブミンと緑色蛍光タンパク質(GFP)(ミリポア社、カリフォルニア州テメキュラ)の分解を2つの異なる方法で計測した。

OVA degradation was assessed as previously described (28).
卵白アルブミンの分解は、以前述べたのと同様に分析した。

previously described: 樹状細胞は取り込んだタンパク質を完全には分解しない(ペプチドを抗原提示するため)。ファゴソームへのNADPHオキシダーゼ動員をRab27aにより制御することでpHを調整している

Briefly, OVA protein was conjugated covalently to 3-μm latex beads (Polysciences) according to the manufacturer's instructions.
簡単に言えば、卵白アルブミンは、製造元の指示に従って3マイクロメートルのラテックスビーズ(ポリサイエンス社)へ共有結合させた。

Conjugation was confirmed by flow cytometry.
結合はフローサイトメトリーにより確認した。

Next, 1 × 10^7 CD11c+ DCs derived from ethanol or control groups were resuspended in 200 μl of CF medium.
次に、エタノール群もしくはコントロール群由来の10の7乗個のCD11c陽性DCを、200マイクロリットルのクローンフード(CF)培養液に浮遊させた。

※resuspended: 水中に浮遊させた、再懸濁させた。resuspended frozen-thawed human red blood cell 「赤血球浮遊液」

Protease inhibitors (Roche minitablet) were added to the medium as a separate control for assessment of protein degradation.
タンパク質分解の分析のため、独立したコントロールとして、プロテアーゼ阻害剤(ロシュ社ミニタブレット錠)を培養液に加えた。

Another control included DCs pulsed with unconjugated beads.
他のコントロールはDCを含んでいたが、(OVAと)結合していないビーズを適用した。

※pulse: (培養の細胞に)(同位体で識別された基質を)適用する (with~)

All tubes were incubated at 37°C for 5 min prior to being pulsed with beads (18μl).
全ての試験管は、ビーズを適用するに先立って、37度Cで5分間インキュベートした(18マイクロリットル)。

OVA-bead or bead-only suspension was added and thoroughly mixed with the cells.
卵白アルブミン結合ビーズの懸濁液、またはビーズのみの懸濁液を加え、完全に細胞と混合した。

After 15 min of incubation at 37°C, 1 ml of cold medium was added to stop phagocytosis, and the free beads were washed away by overlaying the cell suspension on a 2-ml FBS flotation cushion.
37度Cでのインキュベーションの15分後、1ミリリットルの冷たい培養液を加えて貪食を止めた。
2ミリリットルのウシ胎児血清(FBS)の浮揚クッション上に細胞懸濁液をかぶせることにより、フリーのビーズを洗い流した。

After 5 min of centrifugation at 150 × g and 4°C, the pellet was resuspended in 1 ml medium and the overlaying step was repeated twice.
5分後、150×g、4度Cで5分間の遠心分離の後、1ミリリットルの培養液にペレット錠を再懸濁してかぶせるというステップを2回繰り返した。

※pellet: 上記mini tabletか

Next, the cells were resuspended in 2 ml CF medium and incubated at 37°C.
次に、細胞を2ミリリットルのクローンフード培養液に再懸濁して、37度Cでインキュベートした。

At various times, 300 μl was taken from tubes, spun, and lysed overnight, followed by staining with rabbit anti-OVA and FITC-anti-rabbit antibodies.
様々な時間で、300マイクロリットルをチューブに取り、遠心分離でスピンし、一晩、分離させた。
その後、ウサギ抗OVA抗体と、FITC抗ウサギ抗体で、染色した。

※lyse: 溶解する、分離する

The samples were then analyzed by FACSCalibur flow cytometry.
次に、サンプルをFACSキャリバー・フローサイトメーターにより分析した。

FACS (fluorescence-activated cell sorter): 蛍光細胞分析分離装置




The GFP degradation assay was performed by conjugating GFP to 3-μm immunomagnetic beads (Calbiochem) according to the manufacturer's instructions.
GFPを製造元の指示に従って3マイクロモルの免疫磁気ビーズ(カルビオケム社)に結合することにより、GFP劣化の分析を実施した。

Flt3-expanded splenocytes derived from ethanol and control spleens were incubated with the conjugated or unconjugated beads for 5 h.
エタノール群とコントロール群の脾臓に由来する、Flt3で増殖させた脾細胞を、結合磁気ビーズもしくは非結合磁気ビーズと共に、5時間インキュベートした。

The phagocytic cells (including DCs and others) were selected using magnets, and the free beads were separated by Lympholyte (Cedarlane, Hornby, Canada) density gradient centrifugation.
貪食細胞(DCと他の細胞を含む)を磁石を使って選び、フリーのビーズをLympholyte(セダレーン社、カナダホーンビー)密度勾配遠心により分離した。

Lympholyte :リンパ球を分離するための遠心分離用に密度勾配を形成する溶液

Cells containing beads were incubated at 37°C, stained at different times with PE-CD11c, and examined on a FACSCalibur flow cytometer for GFP loss.
ビーズを含む細胞を37度Cでインキュベートして、様々な時間でフィコエリスリン(PE)-CD11c染色し、GFPの喪失をFACSキャリバーフローサイトメーター上で試験した。

As controls, GFP-bead-pulsed and fixed phagocytic cells or unconjugated bead-pulsed cells were included in the analysis.
コントロール群として、GFP-ビーズを適用・固定した貪食細胞、または非結合ビーズを適用した細胞を分析に加えた。



HEL48-61 peptide presentation.
ニワトリリゾチーム48-61残基ペプチドの抗原提示

CD11c+ splenic DCs were cultured in CF containing 1 mg/ml HEL protein for 25 h.
CD11c陽性の脾臓DCを、1ミリグラム/ミリリットルのニワトリリゾチームタンパク質(HEL)を含むクローンフード(CF)で25時間培養した。

Cells (1 × 10^6) were removed at different times, washed with Hanks' balanced salt solution (HBSS), and stained with PE-CD11c and mouse Aw.3.18 antibody (4), followed by staining with FITC-anti-mouse antibody.
その細胞(10の6乗)を様々な時間で除去、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で洗浄し、PE-CD11cとAw.3.18で染色してから、それをFITC-抗マウス抗体で染色する。

Aw.3.18 antibody: マウスのMHCクラスII分子であるI-Akに結合した、HEL48-62残基を認識するモノクローナル抗体

CD11c+ cells were gated and analyzed for FITC signals via FACSCalibur analyses.
CD11c陽性の細胞をFACSキャリバー分析装置にかけて、FITCシグナルを分析した。

The mean fluorescence intensity (MFI) at each time point was subtracted from that at time point 0 and divided by that at time point 0 [relative MFI = (tx - t0)/t0].
それぞれの時間点での平均蛍光強度(MFI)を、時間点0のMFIから引き、時間点0のMFIで割った [相対的MFI = (tx - t0) / t0]。



Peptide presentation assays.
ペプチド提示の分析

Stimulator DCs, isolated from ethanol or control diet-fed mice, were pulsed with soluble OVA323-339 peptide at the indicated concentrations (10 and 1 μg/ml), using 10^7 cells/ml in CF medium, for 20 (long pulse) or 2 (short pulse) hours.
エタノール食マウスもしくはコントロール食のマウスから分離した刺激細胞であるDCに、可溶性の卵白アルブミンペプチド323-339残基を、指示した濃度(10マイクログラム/ミリリットルと1マイクログラム/ミリリットル)で、CF培養液1ミリリットルあたり10の7乗の細胞を使い、20時間(長時間適用)もしくは2時間(短時間適用)、適用した。

Cells were then washed extensively and used for coculture with responder T cells.
次に細胞を十分に洗浄し、応答側であるT細胞と共培養した。

Responder T cells were either OVA-specific DO11 CD4+ T-cell hybridomas or sensitized primary T cells.
応答側であるT細胞は、卵白アルブミン特異的なDO11系列CD4陽性の不死化ハイブリドーマT細胞か、卵白アルブミン特異的に1次感作されたT細胞である。

When DO11.10 cells were employed for ELISAs, IL-2 levels were measured at 18 h of coculture.
DO11.10細胞をELISAに利用して、共培養して18時間時のIL-2濃度を計測した。

※DO11.10: DO11.10のTCRは、マウスのMHCクラスII分子の一つであるI-Adに提示された卵白アルブミンの323-339番目残基のみを特異的に認識する

To obtain antigen-sensitized T cells, BALB/c mice were immunized subcutaneously (s.c.) on the back with 100 μg of OVA-complete Freund's adjuvant (OVA-CFA) and (incomplete) emulsion on days 0 and 7, respectively.
抗原に感作したT細胞を得るため、100マイクログラムの卵白アルブミン完全アジュバント(OVA-CFA)を初日に、(不完全の)エマルジョンを7日目に、それぞれBALB/cマウスの背中に皮下免疫(s.c.)した。

The mice were sacrificed on days 12 to 15, and T cells were isolated from the spleen by use of pan-T-cell or CD4+ T-cell isolation microbead kits (Miltenyi Biotec).
マウスを12日目と15日目に殺して、汎T細胞用もしくはCD4陽性T細胞用の分離マイクロビーズキット(ミルテニーバイオテク社)を使い、脾臓からT細胞を分離した。

For ELISA measurements, 1 × 10^5 T cells were cocultured with 1 × 10^2 to 1 × 10^5 DCs in 96-well plates for 1 to 3 days.
ELISA計測用に、10の5乗個のT細胞を、10の2乗個から10の5乗個のDCと共に、96穴プレートで1日から3日間、共培養した。



Cell proliferation assay.
細胞増殖の分析

CFSE (Molecular Probes) labeling of T cells was performed with 5 μM carboxyfluorescein.
CFSE蛍光分子(分子プローブ)によるT細胞の標識を、5マイクロモルのカルボキシフルオレセインで実施した。

Cells were labeled in a 50-ml Falcon tube with 1 × 10^7 cells/ml in HBSS supplemented with 5% FBS.
50ミリリットルのファルコンチューブにおいて5%ウシ胎児血清(FBS)を足したハンクス平衡塩溶液(HBSS)で、1ミリリットルあたり10の7乗個で細胞を標識した。

Cells were washed three times with 10 volumes of HBSS containing 5% FBS and subsequently used for coculture experiments.
5%FBSを含む10倍量のHBSSで細胞を3度洗浄して、その後の共培養実験で使用した。

On day 6, the cells were harvested and stained with PE-TCR-β and PerCP-CD8a.
6日目、細胞を採取し、PE-T細胞レセプターベータ(PE-TCR-β)とペリジニンクロロフィル蛋白質(PerCP)-CD8aで染色した。

TCR-β+ cells were gated, and CD8+ and CD8- cells were analyzed for CFSE dilution.
TCR-β陽性の細胞を選び出し、CD8陽性と陰性の細胞をCFSE蛍光の希釈で分析した。



As a second approach to measure T-cell proliferation, [3H] thymidine was added to 96-well plates at a concentration of 1 μCi/well 18 h before measurement.
T細胞増殖を計測する2番目のアプローチとして、96穴プレートに1マイクロキュリー/1穴の濃度で、計測の18時間前に[3H]チミジンを加えた。

※[3H] thymidine: 水素(H)の放射性同位体、3Hで放射標識したチミジン

※Ci (curie): キュリー。放射能の測定単位

After being labeled, cells were transferred to 96-well V-bottom plates and washed extensively (three times), and their radioactivity was determined by use of a TopCount scintillation counter.
標識した後、細胞は96穴のV底型プレートに移し、十分に(3回)洗浄した。
放射能はパッカード社のトップカウント・シンチレーションカウンターにより決定した。

※scintillation counter: 放射線が蛍光板に衝突する時の光点を計測する計数器。トップカウントは96穴プレートから専用フィルターで回収して液体シンチレータを加えて計測する



ELISAs.
エリザ

IL-2 (eBioscience) measurements were performed according to the manufacturer's instructions.
IL-2 (イーバイオサイエンス)計測を、製造元の指示に従って実施した。



Costimulatory molecule expression.
共刺激分子の発現

Freshly isolated or mature DCs [cultured overnight with 200 ng/ml LPS or poly(I:C) for 24 h] were stained for costimulatory molecule expression as well as for CD11c.
新しく分離した、もしくは成熟したDC (200ナノグラム/ミリリットルのLPSやポリイノシンポリシチジン酸と一晩培養)は、CD11cに加えて共刺激分子の発現を染色した。

※poly(I:C) 合成二本鎖RNAポリイノシンポリシチジン酸。TLR3を活性化する

The CD11c+ cells were gated and analyzed for the expression of the indicated costimulatory molecules.
CD11c陽性細胞を選別して、指示した共刺激分子の発現を分析した。
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by travelair4000ext | 2013-01-23 16:08 | 翻訳  

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