アルコールと樹状細胞04

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3147329/#__sec14title

RESULTS
結果1-3




Ethanol suppresses allogeneic antigen presentation.
エタノールは同種異系の抗原提示を抑制する



The inhibitory effect of ethanol on allogeneic peptide presentation by CD11c+ DCs to T cells (1, 20, 21) was assessed further in this study.
CD11c陽性DCはT細胞に対して同種異系ペプチドを抗原提示し、エタノールはそれを阻害する。
この研究ではその阻害効果をさらに分析した。

In this regard, CD11c+ DCs isolated from spleens of both BALB/c and CBA/caj mice were cocultured with enriched T cells derived from C57BL/6 mouse spleens.
この点について、BALB/cとCBA/cajマウスの脾臓から分離したCD11c陽性DCを、C57BL/6マウスの脾臓から分離した多数のT細胞と共に培養した。

T-cell activation was determined via IL-2 secretion measured by ELISA in cocultures, while proliferation of CD4+ and CD8+ T cells was detected by both CFSE labeling and [3H]thymidine incorporation.
共培養したT細胞の活性化は、ELISAで計測したIL-2分泌量により決定した。
CD4陽性・CD8陽性T細胞の増殖は、CFSE蛍光分子での標識と、[3H]放射標識チミジンの取り込みで検出した。

Ethanol suppressed proliferation and IL-2 secretion by T cells in DC-T-cell cocultures (Fig.1 A to D).
DCとT細胞を共培養するとき、エタノールはT細胞の増殖とIL-2分泌を抑制した(Fig.1、AからD)。



Fig. 1.
Chronic ethanol exposure alters endogenous peptide presentation by murine BALB/c and CBA/caj DCs to allogeneic C57BL/6 T cells.
慢性的なエタノール曝露は、マウスのBALB/cとCBA/cajのDCから、同種異系のC57BL/6のT細胞への、内因性ペプチドの抗原提示を変化させる。

(A) LPS-matured splenic CD11c+ DCs were purified from ethanol or isocaloric diet-fed CBA/caj mice and were cultured for 3 days with negatively selected T cells obtained from C57BL/6 mice.
エタノール食か同カロリー食を与えたCBA/cajマウスの脾臓から、LPSで成熟させたCD11c陽性DCを精製した。
ネガティブセレクションを受けたT細胞をC57BL/6マウスから得て、共に3日間培養した。

IL-2 levels in cocultures were measured via ELISA as an indicator of T-cell activation.
T細胞活性化の指標として、共培養中のIL-2濃度をEILSAで計測した。

Control DCs were significantly more potent at activating T cells (P < 0.01).
コントロール食のDCは、T細胞を活性化する能力が有意に高かった(P < 0.01)。

(B) DCs were purified from ethanol or control diet-fed BALB/c mice and then cultured with C57BL/6 T cells.
エタノール食かコントロール食のBALB/cマウスからDCを精製し、C57BL/6のT細胞と共培養した。

BALB/c DCs derived from control diet-fed mice were also significantly more potent activators of T cells (P < 0.01).
コントロール食のBALB/cマウスから得られたDCも、T細胞を活性化する能力がエタノール食のDCより高かった。

(C) T-cell proliferation responses were assessed by CFSE dilution via flow cytometry.
T細胞の増殖応答を、フローサイトメトリーでCFSE希釈により分析した。

Ethanol or control diet-fed CBA/caj mouse-derived DCs were cocultured with C57BL/6 mouse-derived T cells.
エタノール食かコントロール食のCBA/cajマウス由来のDCを、C57BL/6由来のT細胞と共培養した。

Labeled T cells were cultured for 5 days with DCs, and TCR-β+ CD8+ and TCR+ CD8- cells were gated for analyses.
5日間、標識したT細胞をDCと培養し、TCR-β陽性CD8陽性細胞とTCR陽性CD8陰性細胞(CD4陽性)とを分析に通した。

Proliferation was reduced in ethanol group-derived DC cocultures (results are representative of three experiments).
エタノール群由来のDCと共培養すると、増殖は減少した (結果は3回の実験の代表である)。

※FACS Calibar: FLは、検出用の蛍光チャネル。FL1(530nm前後、CFSE 517nm、FITC 530nm、緑)、FL2(585nm前後、PE 585nm、黄橙)、FL3(670nm前後、PerCP 680nm、赤)。FL1の値が小さいほど細胞ごとの蛍光量が減少した、つまり増殖が進んだことを表す

(D) Ethanol or control diet-fed BALB/c mouse-derived DCs were cocultured with C57BL/6 mouse-derived T cells.
エタノール食かコントロール食のBALB/cマウス由来のDCを、C57BL/6マウス由来のT細胞と共培養した。

[3H]thymidine incorporation was used to monitor cell proliferation.
[3H]チミジン取り込みを細胞増殖の測定に使用した。

T-cell proliferation induced by mature BALB/c DCs derived from chronically ethanol-fed mice was significantly reduced.
慢性的にエタノール食を与えたマウスに由来するBALB/cの成熟DCは、T細胞増殖の誘導が著しく減少した。

(E) DCs obtained from ethanol or control diet-fed BALB/c mice were pulsed with full-length OVA for 20 h and cocultured with the DO11 T-cell line overnight.
エタノール食かコントロール食のBALB/cマウスから得たDCに、完全な卵白アルブミンタンパク質を20時間適用し、DO11のT細胞系列と一晩共培養した。

Subsequently, IL-2 levels were measured in the supernatant via ELISA as an indicator of antigen-specific activation of T cells.
続いて、抗原特異的なT細胞活性化の指標として、ELISAにより上澄み中のIL-2濃度を計測した。

DCs derived from control-fed mice presented OVA more efficiently than those derived from the ethanol-fed animals.
コントロール食マウス由来のDCは、エタノール食のマウスよりも効果的に卵白アルブミンを提示した。



Ethanol does not alter the kinetics of exogenous antigen degradation following endocytosis.
エンドサイトーシスされた外因性抗原は分解されるが、エタノールはその動態を変化させない

※kinetics: 動力学、動態(動くようす)。速度論、反応速度。反応の仕組み



Previous studies suggested that ethanol does not alter phagocytosis or pinocytosis of exogenous antigens by DCs (1).
以前の我々の研究では、エタノールはDCによる外因性抗原の食作用または飲作用を変化させないということが示唆されていた。

However, Osna et al. reported that ethanol inhibited proteasomal degradation of peptides and thus reduced their presentation by MHCI molecules in hepatocytes (26).
しかしオスナらの報告によれば、エタノールはプロテアソームによるペプチドの分解を阻害し、ゆえに肝細胞でMHCクラスI分子による抗原提示を減少させた。

To resolve these discordant observations and to further explore the possible inhibitory influence of ethanol on the processing of exogenous antigens taken up through an endocytic process as a potential mechanism for depressed T-cell activation, we compared the kinetics of endocytosed OVA protein degradation by DCs isolated from control and ethanol-fed BALB/c mice.
我々の目的は、これらの一致しない観察結果を解決することだった。
T細胞の活性化を抑制する潜在的なメカニズムとして、エンドサイトーシスにより取り込まれた外因性抗原のプロセシングにエタノールが与える阻害的な影響の可能性を、さらに研究しようとした。
我々は、コントロール食とエタノール食を与えたBALB/cマウスから分離したDCに、卵白アルブミンタンパク質をエンドサイトーシスさせ、その分解の動態を比較した。

In this experiment, latex beads were conjugated with OVA, and CD11c+ splenic DCs were briefly pulsed.
この実験では、ラテックスのビーズを卵白アルブミンに結合させ、そこへCD11c陽性の脾臓DCをしばらく適用した。

※latex particle: ラテックス粒子。ポリスチレンなどの共重合体(単量体の重合体)粒子。疎水性が高く、Igの疎水部分(Fc)などと疎水結合する

Cells were washed to remove free beads and then incubated at 37°C (28).
DCに取り込まれなかったフリーのビーズを取り除くために細胞を洗浄し、次に37度Cでインキュベートした。

At various times, DCs were harvested, lysed, stained with OVA-specific and FITC-coupled secondary antibodies, and analyzed by flow cytometry (Fig.2 A).
様々な時間で、DCを採取、溶解し、卵白アルブミン特異的かつFITCと結合させた二次抗体により染色してから、フローサイトメトリーで分析した(Fig.2 A)。

Protease inhibitors were added as a control for antigen degradation by DCs; uncoated beads were included as an additional control for specificity.
DCによる抗原分解の対照コントロールとして、プロテアーゼ阻害剤を加えた。
さらに、特異性を評価するための追加コントロールとして、卵白アルブミンを結合していないラテックスビーズを加えた。

※CD11c+脾臓DC(エタノール / コントロール)
・ラテックスビーズ-卵白アルブミン + 通常
・ラテックスビーズ-卵白アルブミン + プロテアーゼ阻害剤
・ラテックスビーズのみ
ここへ、卵白アルブミンを認識する抗体(蛍光で標識)を加えた

There was comparable and equal degradation of OVA by DCs derived from both ethanol-fed and control mice (Fig.2 A).
DCによる卵白アルブミンの分解は、エタノール食とコントロール食マウスどちらからの由来でも似たような結果だった(Fig.2 A)。

This finding was also recapitulated by the use of another protein (GFP), which confirmed the results observed with the OVA molecule (Fig.2 B).
この研究結果はまたGFPのような他のタンパク質を使っても再現され、OVA分子で観察された結果を正しいと立証した(Fig.2 B)。

Therefore, there appears to be no defect in exogenous antigen uptake and degradation by DCs derived from chronically ethanol-fed mice under these experimental conditions.
ゆえに、このような実験的環境下でマウスに慢性的にエタノール食を与えても、DCによる外因性抗原の取り込みと分解においては、障害は起きないようである。



Fig. 2.
Chronic ethanol consumption in mice does not alter processing of exogenous endocytosed antigens by DCs.
マウスに慢性的にエタノールを消費させても、DCによりエンドサイトーシスされた外因性抗原のプロセシングは変化しない

(A) DCs derived from control and ethanol-fed mice degraded OVA with similar kinetics.
コントロール食とエタノール食を与えたマウス由来のDCは、同じような速度で卵白アルブミンを分解した。

As a control, DCs were pulsed with uncoated beads (no OVA) or with OVA-coated beads in the presence of a protease inhibitor cocktail (PI).
対照コントロールとして、プロテアーゼ阻害剤の混合物(PI)の存在下で、卵白アルブミンを結合させていないビーズ(卵白アルブミンが無い)、もしくは卵白アルブミンを結合させたビーズを、DCに適用した。

The former (negative control) showed no signal; the latter (positive control) showed uniform signals across different time points.
前者(ネガティブ対照群)は、シグナルを示さなかった。
後者(ポジティブ対照群)は、どの時間でも同じシグナルを示した。

The inset shows the uncoated bead population measured by flow cytometry.
挿入した図(矢印)は、結合させていないビーズの集団をフローサイトメトリーで計測したものを示す。

(B) A second antigen degradation assay was performed with GFP-coated beads.
抗原分解について二つ目の分析は、GFPでコートしたビーズで実施した。

Flt3L-expanded splenocytes were pulsed with GFP-coated magnetic beads or uncoated beads (beads only).
Flt3Lで増やした脾細胞に、GFPでコートした磁力ビーズ、または非コートのビーズ(ビーズのみ)を適用した。

Phagocytic cells were selected through a magnetic field, cultured at 37°C, and monitored over time for degradation of GFP.
磁場で貪食細胞を選び、37度Cで培養して、GFPの分解にかかる時間を観察した。

As a further control, DCs were pulsed with GFP-beads and fixed to ensure that the signal loss was specific for proteolytic degradation.
さらなるコントロールとして、蛍光シグナルの喪失がタンパク質の分解に特異的であることを確認するため、DCにGFPビーズを適用してから固定した。

※結果:
コントロール食: 41.11(0h)、36.03(2h)、33.82(5h)、30.22(10h)、27.24(17h)、26.80(24h)
 14.31減少
エタノール食: 37.95(0h)、31.36(2h)、29.10(5h)、28.17(10h)、26.21(17h)、23.27(24h)
 14.68減少
ビーズのみ: 18.67(0h)、16.47(2h)、15.29(10h)
 3.38減少
固定: 39.82(0h)、35.09(2h)、33.30(10h)
 6.52減少

※MFI (mean fluorescence intensity): 平均蛍光強度

※fix: パラホルムアルデヒドなどにより固定する



Pulsing of DCs with OVA323-339 peptide demonstrates impaired antigen-specific T-cell activation.
DCに卵白アルブミン323-339残基を適用する実験で、エタノールは抗原特異的なT細胞の活性化を障害することが判明する



To further clarify the role of antigen processing, we pulsed ethanol-derived and control DCs with a short, “ready-to-present” 17-amino-acid OVA peptide (OVA323-339).
抗原プロセシングの役割をさらに明らかにするため、我々はエタノール由来・コントロール由来のDCに、「提示の準備ができた」17アミノ酸残基の短い卵白アルブミンペプチドを適用した。

These experiments revealed that when DCs were pulsed with small amounts of OVA323-339 peptide (1 μg/ml), presentation of the peptide by DCs derived from ethanol-fed animals to both DO11 T cells and OVA-sensitized primary T cells (CD4+ and pan-T cells) was impaired, as seen by IL-2 measurements (Fig.3 A to C).
この実験で、少量の卵白アルブミンペプチド323-339残基(1マイクログラム/ミリリットル)をDCに適用すると、エタノール食マウスに由来するDCではペプチドの抗原提示が障害されたことが明らかになった。
IL-2の計測に見られるように(Fig.3 AからC)、それはDO11T細胞、卵白アルブミンに感作した主要なT細胞(CD4陽性と汎T細胞)、どちらに対してもである。

These results suggest that ethanol may alter the transport of peptide-MHCII complexes to the cell surface and/or influence peptide loading of MHCII molecules rather than affecting the degradation of exogenous antigens into immunogenic small peptides as shown in Fig. 2.
これらの結果が示唆するのは、エタノールはペプチド-MHCクラスII複合体の細胞表面への輸送を変化させ、ペプチドのMHCクラスII分子へのロードに影響する、その両方もしくはどちらかかもしれないということである。
Fig.2に示したように、エタノールは外因性抗原を免疫原性のある小さいペプチドへ分解する過程には影響しない。



Fig. 3.
Pulsing of DCs with “ready-to-present” OVA323-339 peptide demonstrates impaired antigen-specific T-cell activation produced by chronic ethanol consumption.
DCに「抗原提示の準備ができた」卵白アルブミンペプチド323-330残基を適用すると、抗原特異的なT細胞の活性化は障害されていることが明らかになるが、その障害は慢性的にエタノールを消費することにより引き起こされる。

(A) DCs were pulsed with OVA323-339 peptide at different concentrations and cocultured with DO11 T cells for 18 h.
DCに卵白アルブミンペプチド323-339残基を異なる濃度で適用し、DO11T細胞と18時間共培養した。

IL-2 levels measured via ELISA were used to assess T-cell activation.
IL-2濃度をELISAで計測し、T細胞の活性化を調べた。

HEL was used as a control for antigen specificity, and “T cells only” was a negative control that lacked DC additions.
ニワトリリゾチーム(HEL)は抗原特異性のための対照として使った。「T細胞のみ」はDCを加えないネガティブ対照である。

DCs derived from chronically ethanol-fed mice had impaired OVA peptide presentation.
慢性的にエタノール食を与えたマウスに由来するDCは、卵白アルブミンの抗原提示が障害された。

DCs were pulsed with OVA323-339 peptide and cocultured with pan-T cells (B) or CD4+ T cells (C) isolated from mice previously immunized with OVA protein.
DCに卵白アルブミンペプチド323-330残基を適用し、前もって卵白アルブミンタンパク質で免疫したマウスから分離した汎T細胞(B)、CD4陽性ヘルパーT細胞(C)と共に培養した。

Ethanol diet-fed mouse-derived DCs pulsed with the OVA peptide were unable to restore T-cell activation to levels observed with control DCs.
エタノール食を与えたマウス由来のDCに卵白アルブミンペプチドを適用しても、T細胞の活性化をコントロール食で観察された量まで回復することができなかった。
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by travelair4000ext | 2013-01-28 11:40 | 翻訳  

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