アルコールと樹状細胞05

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3147329/#__sec14title

RESULTS
結果4-7




Ethanol influences the abundance of peptide-MHCII complex formation on the DC surface.
エタノールはDC表面のペプチド-MHCクラスII複合体の形成量に影響する



In order to assess the possible effects of ethanol on the presentation of specific peptide-MHCII complexes on the surfaces of DCs, we employed the monoclonal Aw3.18 antibody, which detects HEL48-61 peptide-MHCII complexes in the I-Ak genetic background (Fig. 4A). (4).
抗原特異的なペプチド-MHCクラスII複合体によるDCの抗原提示にエタノールが影響する可能性を調べるため、我々はモノクローナル抗体のAw3.18を使用した。
Aw3.18抗体は、I-Akを遺伝的背景にもつマウスにおいて、HEL48-61残基ペプチド-MHCクラスII複合体を検出する(Fig.4 A)。

※Aw.3.18 antibody: マウスのMHCクラスII分子であるI-Akに結合した、HEL48-62残基を認識するモノクローナル抗体

The kinetics of pHEL48-61-MHCII accumulation on the surfaces of CD11c+ DCs isolated from ethanol or control diet-fed CBA/caj mouse spleens were compared at various times after pulsing of cells with HEL protein for approximately 24 h.
エタノール食もしくはコントロール食を与えたCBA/caj脾臓から分離したCD11c陽性DCにHELタンパク質を約24時間適用した後、細胞膜表面にHELペプチド48-61残基-MHCクラスIIが集積する動態を様々な時間で比較した。

We detected substantially larger amounts of peptide-MHCII complexes in DCs isolated from control diet-fed mice than in those from ethanol-fed mice (Fig.4 A).
コントロール食マウスから分離したDCでは十分に大量のペプチド-MHCクラスII複合体が検出されたが、エタノール食マウス由来のDCでは少なかった(Fig.4 A)。

This difference between DCs derived from ethanol-fed and control mice was observed after 8 weeks of the diet regimen but not after 4 weeks of ethanol feeding (Fig.4 B).
このエタノール食とコントロール食によるDC間の違いは8週間の食事法の結果だが、4週間のエタノール食ではこの違いは見られなかった(Fig.4 B)。

This finding confirms previous studies which observed equal amounts of MHC class II molecules expressed on the surfaces of DCs isolated from 4-week chronically ethanol-fed and isocaloric pair controls under the same experimental conditions (1).
この実験結果は、同じ条件で慢性的なエタノール食と同カロリーのコントロール食を4週間だけ与えたマウスから分離したDCでは、MHCクラスII分子の発現の量が等しかったという以前の研究での観察を確かめるものであった。



Fig. 4.
Chronic ethanol consumption in mice results in reduced peptide-MHCII complex formation on the surfaces of DCs.
マウスの慢性的なエタノール消費は、DC表面のペプチド-MHCクラスII複合体の形成を減少させる結果になる。

(A) CD11c+ splenic DCs isolated from control or ethanol diet-fed mice (8 weeks) were pulsed with HEL protein.
コントロール食とエタノール食(8週間)のマウス脾臓から分離したCD11c陽性のDCに、HELタンパク質を適用した。

At different times, cells were stained with Aw3.18 antibody followed by FITC-anti-mouse IgG and were visualized via FACSCalibur flow cytometry.
異なる時間で、Aw3.18抗体を結合させ、FITC-抗マウスIgG抗体により細胞を染色し、FACSキャリバー・フローサイトメトリーで視覚化した。

The signal for each time studied was calculated as follows: relative MFI = (tx - t0)/t0.
研究するそれぞれの時間のシグナル強度は、以下のように計算した。
相対的な平均蛍光強度 = (tx - t0) / t0

Unpulsed DCs were used as a negative control.
HELタンパク質を適用しなかったDCをネガティブ対照として使った。

DCs derived from control diet-fed mice displayed strikingly higher peptide MHCII levels than those isolated from ethanol-fed animals.
コントロール食マウス由来のDCは、エタノール食マウス由来よりも著しく高いペプチド-MHC複合体の濃度を示した。

The graph is representative of three independent experiments.
図表は3回の独立した実験の代表である。



(B) DCs purified from 4-week ethanol-fed CBA/caj mice were pulsed with HEL, washed, and incubated at 37°C for analyses of peptide-MHCII complex formation on the DC surface.
エタノール食を4週間だけ与えたCBA/cajマウスから精製したDCにHELを適用し、洗浄して37度Cでインキュベート後、DC表面に形成されるペプチド-MHCクラスII複合体を分析した。

OVA protein pulsing was used as a specificity control/negative control.
卵白アルブミンタンパク質を適用したものを、特異性に関する対照、またはネガティブの対照として使用した。

As observed previously, 4 weeks of ethanol feeding was not sufficient to alter the immune response associated with depressed DC function (1, 6, 8-10); rather, 8 weeks of chronic ethanol exposure was required.
以前観察したように、DCの機能を抑制するように免疫応答を変更するには、4週間のエタノール食は十分ではなかった。
それどころか、8週間の慢性的なエタノール曝露が必要だった。



Peptide-MHCII complex abundance is not sufficient to differentially activate T cells.
ペプチド-MHCクラスII複合体の量の違いだけでは、T細胞を活性化させる能力に差が生じない



To test whether lower levels of peptide-MHCII complexes found on DCs isolated from ethanol-fed mice were responsible for reduced DO11 T-cell activation, we fixed DCs after a 20-h pulse with OVA.
エタノール食を与えたマウスから分離したDC上でペプチド-MHCクラスII複合体の濃度が低いかどうかを調べるため、我々は卵白アルブミンで20時間適用した後のDCを固定した。

※fix, fixation: 固定。パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)により化学的に固定したり、急速冷凍法により物理的に固定することをいう

Because fixation of DCs following their pulse with antigen eliminates secretion of cytokines and the clustering of costimulatory molecules, an assay in which DCs are fixed prior to coculture with T cells was deemed informative for testing the role of reductions in the abundance of peptide-MHCII complexes in the suppressed T-cell activation by DCs following ethanol exposure (Fig.4 A).
抗原を適用した後にDCを固定すると、サイトカインの分泌と、共刺激分子の集合は、細胞から排除される。
そのため、T細胞と共培養する前にDCを固定する分析を実施した。
エタノール曝露後はDCによるT細胞の活性化が抑制されるが、そこでペプチド-MHCクラスII複合体の量の減少が果たす役割を測るための情報が得られると考えられた(Fig.4 A)。

Such an assay would suggest the additional requirement for DC cytokine secretion to activate T cells.
そのような分析は、DCのサイトカイン分泌がT細胞を活性化するための追加条件を示唆しただろう。

However, we did not observe a significant difference in T-cell activation between fixed DCs derived from chronically ethanol-fed and control animals (Fig. 5), although control DCs tended to be better stimulators of T-cell activation, consistent with higher levels of peptide-MHCII complex expression on their surfaces.
コントロール食のDCはその表面に高レベルのペプチド-MHCクラスII複合体が発現しており、T細胞の活性化を刺激する能力が高い傾向はあった。
しかし、それにもかかわらず、慢性的エタノール食マウスとコントロール食マウスの固定したDCの間で、T細胞活性化において統計的に有意な違いは見られなかった(Fig.5)。




Fig. 5.
Effect of DC fixation on activation of T cells.
DCを固定することがT細胞の活性化に与える影響

OVA- or HEL-pulsed CD11c+ splenic DCs were fixed before their coculture with DO11 T cells.
DO11T細胞と共培養する前に、卵白アルブミンとニワトリリゾチームを適用したCD11c陽性の脾臓DCを固定した。

Subsequently, IL-2 levels were measured by ELISA after 18 h of culture.
そして、18時間の共培養の後、T細胞活性化の指標としてIL-2濃度をELISAにより計測した。

There was no statistical difference between fixed DCs derived from both ethanol and control diet-fed mice, since they presented endogenous OVA in the absence of DC cytokine secretion.
エタノール食、コントロール食、どちらからの由来でも、固定したDCの間には統計的な違いは無かった。
なぜならそれらはDCサイトカインの分泌を欠いたまま内因性の卵白アルブミンを提示したからだ。

However, IL-2 levels of fixed DCs were much lower than those observed in nonfixed DCs (P = 0.0006).
しかし、固定したDCのIL-2濃度は、固定しなかったDCよりはるかに低かった(P = 0.0006)。



Ethanol does not impact cross-presentation of exogenous antigens.
エタノールは外因性抗原の交差提示に影響を与えない

※cross-presentation: 交差提示。DCにより取り込まれた抗原は、通常はリソソームにより分解されMHCクラスII分子にロードされる。加えて、リソソームからERへ取り込まれてから細胞質へ逆行輸送されたのちユビキチン化・プロテアソームにより分解され、TAPによりペプチドとして再びERへ取り込まれてMHCクラスI分子にもロードされる。後者を交差提示(クロスプレゼンテーション)という

To determine the potential effects of ethanol on antigen cross-presentation by DCs, we cultured DCs purified from ethanol-fed and isocaloric pair control C57BL/6 mice, pulsed them with full-length OVA (Fig.6 A) or OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) for 20 h (Fig.6 B), and cocultured them with OT-I CD8+ T cells derived from transgenic mice.
DCによる交差抗原提示にエタノールが与える潜在的な影響を解決する目的で、我々はエタノール食と同カロリーのペアフィーディングでのコントロール食を与えたC57BL/6マウスからDCを精製、培養し、完全な卵白アルブミン(Fig.6 A)、もしくは卵白アルブミンのペプチド257-264残基(SIINFEKL)(Fig.6 B)を20時間適用した。
その後、トランスジェニックマウス由来OT-IのCD8陽性T細胞と共培養した。

※SIINFEKL: セリン-イソロイシン-イソロイシン-アスパラギン-フェニルアラニン-グルタミン酸-リシン-ロイシン。C57BL/6マウスのMHCクラスI分子上に提示されたSIINFEKLを特異的に認識するTCRをCD8+Tに発現するOT-Iと、MHCクラスII分子との複合体を認識するTCRをCD4+Tに発現するOT-IIがある

※transgenic mice: 同種異系または異種の遺伝子を導入したマウス

We observed a comparable activation of T cells.
我々はT細胞の活性化を比較した。

Similarly, we detected comparable amounts of peptide 257-264-MHCI complexes on the surfaces of control and ethanol-derived DCs, as quantified by use of a monoclonal antibody specific to the SIINFEKL-MHCI complex for flow cytometry (Fig.6 C).
同様に、我々はコントロールとエタノール由来DC表面の、ペプチド257-264残基-MHCクラスI複合体の量を比較した。
定量化には、SIINFEKL-MHCクラスI複合体に特異的なモノクローナル抗体を使用した(Fig.6 C)。



Fig. 6.
Chronic ethanol consumption does not adversely affect cross-presentation of exogenous antigens.
慢性的なエタノール消費は、外因性抗原の交差抗原提示には悪影響を及ぼさない

DCs obtained from 8-week chronic ethanol or control diet-fed C57BL/6 mice were pulsed with full-length OVA (A) or OVA peptide 257-264 (B) for 20 h and then cocultured with OT-I T cells purified from transgenic mice overnight.
慢性的なエタノール食かコントロール食を8週間与えたC57BL/6マウスから得られたDCに対して、完全長(FL)の卵白アルブミン(A)、もしくは卵白アルブミンのペプチド257-264残基(B)を20時間適用し、トランスジェニックマウスから精製したOT-IのT細胞と一晩、共に培養した。

Both full-length protein and short peptides of exogenous OVA were cross-presented via MHCI at similar efficiencies by ethanol-exposed and control DCs.
外因性である卵白アルブミンの完全なタンパク質と短いペプチドのどちらも、エタノール曝露DCとコントロールDCにより同じような有効性をもって、MHCクラスI経由で交差提示された。

(C) Peptide-MHCI complexes on the DC surface were quantified by use of a monoclonal antibody specific to SIINFEKL-MHCI after pulsing of cells with full-length OVA protein or with peptide 257-264.
DC表面上のペプチド-MHCクラスI複合体は、完全長の卵白アルブミンタンパク質か257-264残基のペプチドを細胞に適用後、257-264残基(SIINFEKL)-MHCクラスI複合体に特異的なモノクローナル抗体を使って定量化した。

Eight-week ethanol exposure had no effect on peptide-MHCI presentation on the DC surface after 24 h of pulsing with peptide 257-264.
8週間のエタノール曝露は、ペプチド257-264残基を24時間適用した後でのDC表面上のペプチド-MHCクラスI抗原提示には何の影響も無かった。

Peptide 323-339 was used as an antigen specificity control for monoclonal antibody reactivity.
323-339残基のペプチドは、モノクローナル抗体の反応を見るため、抗原特異性の比較対照として使用した。



Analysis of costimulatory molecule expression.
共刺激分子の発現を分析する



The expression of costimulatory molecules on the DC surface was assessed in response to chronic ethanol exposure.
慢性的なエタノール曝露への応答により、DC表面上の共刺激分子の発現がどうなるかを評価した。

Previously, CD80, CD86, and CD40 levels were examined (1, 20).
以前、CD80、CD86、CD40の濃度が検討された。

We extended these experiments by examining the expression of other costimulatory molecules which may have activating and/or inhibitory functions, since they may contribute to the reduced T-cell priming by ethanol-derived DCs.
我々はこれらの実験を発展させ、活性化機能と抑制機能のどちらか、もしくは両方を持っているかもしれない他の共刺激分子の発現を検討した。
エタノール食由来のDCでT細胞のプライミングが減少することの原因かもしれないからである。

※priming: 抗原による初回の活性化

To do this, immature or LPS- or poly(I:C)-matured DCs were stained with anti-41BB-L, anti-B7-DC, anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-OX40L, and anti-ICOS-L antibodies, with anti-CD86 as a positive control (Fig. 7).
このため、未成熟のDCと、リポ多糖またはポリイノシンポリシチジン酸で成熟したDCを、抗41BB-L、抗B7-DC、抗B7-H3、抗B7-H4、抗OX40L、抗ICOS-L抗体で染色した。
抗CD86はポジティブ比較対照である(Fig.7)。

※poly(I:C) 合成二本鎖RNAポリイノシンポリシチジン酸。TLR3を活性化する

Immature DCs expressed both CD86 and ICOS-L.
未成熟DCは、CD86、ICOS-L、どちらも発現はしていた。

However, DCs derived from ethanol-fed animals exhibited further reductions in CD86 expression, as previously described (1).
しかし以前記したように、エタノール食マウス由来のDCはさらにCD86発現の減少を示した。

After maturation with LPS or poly(I:C), DCs did not express the 41BBL, B7-H3, and B7-H4 cell surface molecules.
リポ多糖やポリイノシンポリシチジン酸で成熟させても、DCは細胞表面分子である41BBL、B7-H3、B7-H4を発現しなかった。

However, CD86, ICOS-L, OX40L, and B7-DC (PD-L2) were highly expressed.
しかし、CD86、ICOS-L、OX40L、B7-DC (PD-L2)は高発現した。

More importantly, CD86 and B7-DC surface expression was reduced in matured DCs exposed to chronic ethanol.
さらに重要なことに、エタノールに曝露した成熟DC表面では、CD86とB7-DCの発現は減少していた。

Interestingly, higher expression levels of the inhibitory ICOS-L marker (16, 35) were observed in DCs derived from ethanol-fed mice after maturation with both ligands.
興味深いことに、阻害的マーカーであるICOS-Lは、リポ多糖とポリイノシンポリシチジン酸どちらのリガンドで成熟させても、エタノール食由来のDCで発現が高かった。

In contrast, OX40L levels were comparable between ethanol-fed and control mice.
それとは対照的に、OX40L濃度はエタノール食とコントロール食のマウス間で似ていた。

Thus, chronic ethanol consumption has a major effect on the expression of these DC costimulatory molecules, which may contribute to depressed T-cell activation.
ゆえに、慢性的なエタノール消費は主にこれらDCの共刺激分子の発現に影響する。
そして、それはT細胞の活性化を抑制する原因なのかもしれない。



Fig. 7.
Inhibitory and activating costimulatory molecules are expressed differentially in DCs after chronic ethanol exposure.
慢性的なエタノール曝露したDCでは、抑制的、活性化の共刺激分子の発現に差異が生じる。

DCs freshly isolated from ethanol or control diet-fed BALB/c mice or after maturation for 24 h with LPS or poly(I:C) were stained with CD11c antibodies and for the indicated costimulatory molecules.
エタノール食またはコントロール食のBALB/cマウスから、未成熟なDCと、リポ多糖とポリイノシンポリシチジン酸で24時間成熟させたDCを分離した。
これらをCD11c抗体で染色し、共刺激分子の発現を示した。

The CD11c-high cells were gated and analyzed for the expression of costimulatory molecules.
CD11cを高発現する細胞を通過させ、共刺激分子の発現を分析した。

ICOS-L was upregulated in ethanol-fed mouse-derived DCs, whereas B7-DC and CD86 were downregulated in DCs derived from ethanol-fed mice.
エタノール食由来のDCではICOS-Lは発現が上昇していたが、B7-DCとCD86は発現が減少していた。

OX40L was unchanged, while B7-H3, B7-H4, and 41BB-L were not expressed by mature DCs.
OX40Lは変化しなかった。
B7-H3、 B7-H4、41BB-Lは成熟DCで発現しなかった。

The results represent three independent experiments.
結果は3回の独立した実験の代表である。
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by travelair4000ext | 2013-01-31 02:28 | 翻訳  

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