喫煙とタイトジャンクション03

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3351767/#__sec2title

MATERIALS AND METHODS
資料と方法




Animal care and experiment design
動物飼育と実験デザイン

C57BL/6 female mice at 6 mo of age were housed in a temperature-controlled room with a 12 h light and 12 h darkness cycle and were given food and water ad libitum.
C57BL/6系、メス、6ヶ月齢のマウスを、温度コントロール室で12時間の光と12時間の暗闇の周期の中、食事と水を適宜自由に与えて飼育した。

Mice were placed in an exposure box and exposed to side-stream smoke for 1 h daily for 40 d.
マウスを曝露ボックス内に置き、1日1時間で40日間、副流煙に曝露させた。

Commercial cigarettes (golden monkey, tar: 13 mg; nicotine: 1.1 mg; CO: 15 mg) were used at a dose equivalent to one commercial cigarette’s smoke per day[37].
市販のタバコ(ゴールデンモンキー、タール13mg、ニコチン1.1mg、一酸化炭素15mg)を、市販されているタバコの1日あたりの喫煙と等しい用量で使用した。

※dose equivalent: 線量当量、被曝放射線の人体への生物学的効果を表す用語。または「~と等しい用量」

The animal care procedures described in this study was approved by the University of Wyoming Institutional Animal Use and Care Committee.
この研究で記述されている動物飼育の手順は、ワイオミング大学の動物実験委員会により承認された。



Tissue collection
組織の採集

On the day of necropsy, mice were anesthetized intraperitoneally with tribromoethanol (250 mg/kg body wt).
死体解剖の日、マウスの腹腔内にトリブロムエタノールで麻酔をかけた(250 mg/体重1kgあたり)。

Blood samples were collected from the orbital sinus while mice were under general anesthesia.
マウス眼窩静脈叢から全身麻酔下で血液サンプルを採取した。

Mice were then sacrificed by cervical dislocation.
マウスは頚椎脱臼により犠牲にした。

Large intestines were dissected, flushed with phosphate-buffer saline and then frozen in liquid nitrogen for immunoblotting and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses.
大腸を解剖し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄したのち、液体窒素で冷凍して、免疫ブロットと定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)の分析に使用した。

Cecal contents from each mouse were collected and frozen for microflora analyses.
それぞれのマウスの盲腸の中身を採取して冷凍し、微生物フローラの分析に使用した。



Reagents and antibodies
試薬と抗体

Antibodies against ZO1, ZO2, Claudin3 and Occludin were purchased from Invitrogen (Camarillo, CA).
ZO1、ZO2、クローディン3、オクルディンに対する抗体を、インビトロジェン社(カリフォルニア州カマリロ)から購入した。

Antibodies against phospho- c-Jun N-terminal kinase (SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185), SAPK/JNK, phospho-NF-κB p65 (ser536), NF-κB p65, phospho-IκB kinase (IKK) α/β (Ser176/180), IKKβ, phospho-IκBα, IκBα, phosho-p38 MAP kinase and p38 MAP kinase, phospho-AMP-activated protein kinase (AMPK) α and AMPKα were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA).
リン酸化c-Jun N末端キナーゼ(SAPK/JNK)(スレオニン183/チロシン185リン酸化)、SAPK/JNK、リン酸化NF-κB p65(セリン536リン酸化)、NF-κB p65、リン酸化IκBキナーゼ(IKK)α/β(セリン176/180リン酸化)、IKKβ、リン酸化IκBα、IκBα、リン酸化p38 MAPキナーゼ、p38 MAPキナーゼ、リン酸化AMPキナーゼ(AMPK)α、AMPKαに対する抗体を、セルシグナリング・テクノロジー社(マサチューセッツ州ベヴァリー)から購入した。

※c-Jun N-terminal kinase: c-Jun N末端キナーゼ。LPSや浸透圧ストレスなどにより活性化してc-Junをリン酸化するため、ストレス応答性MAPK(Stress-activated Protein Kinase: SAPK)とも。p38と同じくMAPKの一つ

※NF-κB p65: RelA。p50とともにNF-κBのヘテロ二量体を構成する転写因子

Antibodies against xanthine oxidase (XO), heat shock protein (HSP) 60 and superoxide dismutase (SOD) 1 were purchased from Santa Cruz Biotech Inc.
キサンチンオキシダーゼ(XO)、熱ショックタンパク質(HSP)60、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)1に対する抗体を、サンタクルーズ・バイオテック社(カリフォルニア州サンタクルーズ)から購入した。

Anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody was purchased from Affinity BioReagents (Golden, CO).
抗グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)抗体を、アフィニティ・バイオリエイジェント社(コロラド州ゴールデン)から購入した。

※GAPDH: 解糖系に関与する酵素の一つ



Quantitative reverse transcription PCR
定量逆転写PCR

Total RNA was extracted from powdered large intestine using Trizol(R)Reagent (Sigma, St. Louis, MO), treated with DNase I (Qiagen, Valencia, CA) and purified with RNeasy Mini kit (Qiagen).
細かく砕いた大腸からトリゾール試薬(シグマ社、ミズーリ州セントルイス)を使い全RNAを抽出し、DNAアーゼI(キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア)で処理し、RNeasyミニキット(キアゲン社)で精製した。

cDNA was synthesized with the iScript(TM) cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
cDNA合成キットのiScript(バイオ・ラッド研究所、カリフォルニア州ハーキュリーズ)でcDNAを合成した。

qRT-PCR was conducted on a Bio-Rad CFX96 machine and SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) was used for all qRT-PCR reactions.
qRT-PCRはバイオ・ラッドCFX96機で実施し、qRT-PCR反応にはSYBRグリーンマスターミックス(バイオ・ラッド研究所)を使用した。

※master mix: PCRに使用するDNA鋳型以外の反応液をまとめて調製したもの

Mouse GAPDH was used as the housekeeping gene.
マウスのGAPDHをハウスキーピング遺伝子として使用した。

※housekeeping gene: 分化、未分化に関係なく常に(構成的に)発現している遺伝子。RNAポリメラーゼIIによって転写されるが、TATAボックスの代わりにGCボックスが上流に存在する

Primer sequences are listed in Table 1.
プライマー配列をTable 1に挙げる。

The final primer concentration was 200 nmol for each gene.
最終的なプライマーの濃度は、それぞれの遺伝子に対して200ナノモルだった。

The amplification efficiency was 0.90-0.99.
増幅効率は0.90から0.99だった。

The qRT-PCR conditions were 95 °C, 3 min, and 35 cycles of 95 °C for 10 s, 58 °C for 20 s and elongation step at 72 °C for 20 s.
qRT-PCR状態は95度Cを3分、そして95度Cを10秒間、58度を20秒間、72度を20秒間という周期を35回繰り返した。

At the end of each run, dissociation melting curve was obtained to confirm the purity of PCR products[38].
PCR過程の1回ごとに、融解曲線を得てPCR産物の純度を確認した。

※dissociation / melting curve: 融解曲線。PCR増幅産物のTm値 (melting temperature: DNAの半分が変性して一本鎖となる温度)を確認することで、適切な増幅産物が得られたかどうかを確認することができる。
PCR後に蛍光値をモニターしながら温度を60から95℃へ徐々に上げていくと、SYBR Green Iのようなインターカレーター (DNA二本鎖に結合することで蛍光を発する)の発する蛍光が、ある一定の温度で変性(融解: melting)により急激に低下する (Tm値)。Tm値は鎖の長さやGC含量 (ATより安定)により変化するため、プライマーやプライマーダイマーと、目的のPCR増幅産物とを区別することができる



Table 1
Primer sets used for quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of mouse large intestine tissue
マウス大腸組織の定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用するプライマーのセット



Microflora analyses
微生物フローラの分析

The frozen caecal contents (0.1 g) were homogenized and bacterial genomic DNA was extracted using a QIAamp DNA stool mini kit according to the manufacturer’s instructions (Qiagen, Valencia, CA).
冷凍した盲腸の中身(0.1g)を均質化し、製造元の指示に従いQIAamp DNA糞便ミニキット(キアゲン社)を使って細菌のゲノムDNAを抽出した。

※genomic DNA: ゲノムDNA。遺伝情報の全体をゲノムと呼び、その遺伝情報の本体であるDNAをゲノムDNAと呼ぶ。-ome 「塊、群」

The abundance of specific intestinal bacterial groups was measured by qPCR using Bio-Rad CFX96 machine (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) as described above.
特定の腸内細菌グループの量は、上記の通りバイオ・ラッドCFX96機(バイオ・ラッド研究所)を使ったqPCRにより計測した。

Group specific or kingdom specific 16S rRNA gene primers were listed in Table 2.
グループまたは界に特異的な16SリボソームRNA遺伝子プライマーのリストをTable 2に挙げる。

※kingdom: 分類学上の「界」。かつての動物界や植物界など(今ではそれぞれオピストコンタとアーケプラスチダ)。または「区系界」。動植物の特徴にもとづいて識別される区域

Eubacteria 16S rRNA was used as the housekeeping gene.
ユーバクテリウム属の16S rRNAをハウスキーピング遺伝子として使用した。

※Eubacteria: ユーバクテリウム属。40種類以上から成り、炭水化物を利用する細菌。グラム陽性、嫌気性、非運動性、胞子非形成。ヒトの口腔や腸内フローラを構成する

※16S rRNA: リボソームを構成するRNA(rRNA)の小ユニット(16S)。リボソームは全ての生物に存在するため、塩基配列の変化から系統を分析することができる

※16S: Sは「スベドベリ単位」で、沈降係数(sedimentation coefficient)を表す。遠心分離で分子がどれくらい沈降しやすいかを表す物理量。分子量に比例し(重いほど沈降しやすい)、摩擦係数に反比例する(球状に近いほど沈降しやすい)



Table 2
Primer sets used for quantitative polymerase chain reaction of 16S rRNA of specific bacterial species or genus
細菌の種または属に特異的な16SリボソームRNAを定量ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するために使用したプライマーのセット



Immunoblotting analyses
免疫ブロット分析

Immunoblotting analyses were conducted as previously described[39,40].
免疫ブロット分析を以前に記述したように実施した。

Briefly, protein extracts from the mouse large intestine were separated by 5%-15% sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gradient gels and transferred to nitrocellulose membranes for immunoblotting analyses.
簡単に言えば、マウスの大腸からのタンパク質の抽出物を、5%から15%の濃度勾配ゲルを使ったドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離してニトロセルロース膜に写し、免疫ブロットで分析した。

Band density was normalized according to the GAPDH content[39,40].
バンド濃度はGAPDHの量に従って標準化した。



Statistical analysis
統計的分析

Statistical analyses were conducted as previously described[41-43].
統計的分析を以前に記述したように実施した。

Data were analyzed as a complete randomized design using General Linear Model of Statistical Analysis System (2000).
統計的分析システムの一般線形モデル(2000)を使用して、完全にランダム化されたデザインとしてデータを分析した。

※general linear model: 一般線形モデル。正規分布を扱う。generalized linear model (一般化線形モデル)は正規分布以外も扱う

Mean ± SEM are reported.
平均 ± 標準誤差を報告する。

※SEM (standard error of the mean): 標準誤差。標本を採集した母集団の母平均を推定する場合のばらつきの程度。標準偏差の推定値

Mean difference was separated by a least significant difference multiple comparison test.
平均の違いは最小有意差・多重比較法により分離された。

※least significant difference multiple comparison test: 最小有意差多重比較法。グループ間に差があるかどうかを確かめる分散分析(帰無仮説=グループ間に差はない)の後、どの程度の差があるかを多重比較法の一つである最小有意差検定により明らかにする

Statistical significance is considered as P < 0.05.
P値が0.05未満のとき統計的な有意差があると見なす。
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by travelair4000ext | 2013-02-20 16:17 | 翻訳  

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