代謝性エンドトキシン血症03

http://diabetes.diabetesjournals.org/content/56/7/1761.long#sec-1

RESEARCH DESIGN AND METHODS
研究デザインと方法1




Twelve-week-old male C57bl6/J mice (Charles River, Brussels, Belgium) and CD14 mutant male mice bred in a C57bl6 background (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) were housed in a controlled environment (inverted 12-h daylight cycle, lights off at 10:00 a.m.) with free access to food and water.
12週齢オスのC57BL6/Jマウス(チャールズ・リバー社、ブリュッセル、ベルギー)と、C57BL6遺伝背景で交配されたオスのCD14ミュータントマウス(ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州)を、コントロールされた環境で飼育し(12時間周期で昼夜を交代、光は午前10時でオフ)、餌と水には自由にアクセスさせた。

All of the following animal experimental procedures were validated by the local ethical committee of the Rangueil Hospital and by the Universite catholique de Louvain Animal Ethical Committee.
この後の動物実験の手順は、ラングル病院の地元の倫理委員会とルーベンカトリック大学の動物倫理委員会により承認された。

Mice were fed a control (A04, Villemoisson sur Orge, France) or a high-fat, carbohydrate-free diet for 2 or 4 weeks following protocols.
マウスには、コントロール食(げっ歯類用A04、ヴィルモワソン・シュル・オルジェ、フランス)か、高脂肪で炭水化物を含まない餌を、2週間もしくは4週間、下記の計画で与えた。

The diet contained 72% fat (corn oil and lard), 28% protein, and <1% carbohydrate as energy content (17).
その餌のエネルギー構成は、72パーセントの脂肪(コーン油およびラード)、28パーセントのタンパク質、そして炭水化物は1パーセント未満だった。

In a subset of mice, obesity and diabetes were induced by a high-fat diet and mice killed after 4 or 24 weeks.
マウスのサブセットでは、高脂肪食により肥満と糖尿病を引き起こし、4週間もしくは24週間で殺した。



Energy intake measurements.
エネルギー摂取の計測

Energy intake was recorded twice weekly for 4 weeks, two mice per cage.
1ケージごとに2匹のマウスを入れ、週に2度で4週間、エネルギー摂取を記録した。

Pellets and spillage were weighed separately.
ペレットとこぼれた量は別々に量った。

The mean value for the weekly assessment was calculated.
週ごとに評価するための平均値を計算した。

This method was performed similarly for all assessments.
この方法は全ての評価で同様に実施した。



Surgical procedures, infusions, and isotope measurements.
外科の手順、注射、アイソタイプの計測

Mice were implanted subcutaneously with an osmotic minipump (Alzet Model 2004; Alza, Palo Alto, CA) as previously described (17).
マウスの皮下に浸透圧ミニポンプ(アルゼットモデル2004; アルザ社、パロアルト、カリフォルニア州)を前述のように移植した。

The pumps were filled either with NaCl (0.9%) or LPS (from Escherichia coli 055:B5; Sigma, St. Louis, MO) to infuse 300 μg ・ kg-1 ・ day-1 for 4 weeks.
ポンプは、NaCl(0.9パーセント)か、またはLPS(大腸菌055:B5株由来; シグマ社、セントルイス、ミズーリ州)のどちらかで満たし、1日1キログラムあたり300マイクログラムを4週間注射した。

For the clamp studies, an intrafemoral catheter was indwelled as previously described (18).
クランプ法の研究のために、前述のように内部大腿部カテーテルを留置した。

Insulin sensitivity was assessed by the euglycemic-hyperinsulinemic clamp as described (19).
インスリン感受性を、前述のように正常血糖高インスリンクランプ法により評価した。

※euglycemic-hyperinsulinemic clamp: インスリンを持続的に静注することで高インスリン状態をつくり、さらにグルコースを注入することにより血糖を正常に保つ。この際、グルコースの注入が多いほどインスリン感受性が高い (インスリン抵抗性が低い)

Briefly, 6-h-fasted mice were infused with insulin at a rate of 18 (pharmacological, to assess whole-body insulin sensitivity) or 1 (physiological, to assess the effect of insulin on the inhibition of endogenous glucose production) mU ・ kg-1 ・ min-1 for 3 h.
簡単に述べると、6時間絶食させたマウスに、3時間の間、1分に1キロあたり18ミリユニット(mU)(薬理学的、全身のインスリン感受性を評価)か、1ミリユニット(mU)(生理的、内因性のグルコース新生を阻止する上でのインスリンの影響を評価)のインスリンを注入した。

For glucose turnover measurements, D-(3H)3-glucose (Perkin Elmer, Boston, MA) was simultaneously infused at rate of 30 μCi/kg, as described (17).
グルコース代謝回転を計測するため、前述のようにトリチウム(3H)標識D-グルコース(パーキンエルマー社、ボストン、マサチューセッツ州)を30マイクロキュリー毎キログラムの割合で、同時に注入した。

※turnover: 転換、代謝回転、ターンオーバー。一定の時間内に代謝される量

D-(3H-3)-glucose enrichments were determined from total blood after deproteinization by a Zn(OH)2 precipitate, as described (19).
トリチウム標識D-グルコースの量は前述したように、全血からタンパク質を除去したのち、水酸化亜鉛の沈殿により決定した。

To assess whether CD14 mice were sensitive to LPS-induced inflammation, fasted mice were continuously infused with LPS (0.5 mg ・ kg-1 ・ h-1) for 3 h.
CD14マウスがLPSによる炎症に感受性があるかどうかを評価するために、絶食させたマウスに持続的に3時間、LPSを注入した(0.5ミリグラム、1キロあたり、毎時)。

Liver and white adipose tissue were collected and frozen at -80°C.
肝臓と白色脂肪組織を採集し、-80℃で冷凍した。



Glucose and LPS tolerance tests.
グルコース耐性(耐糖能)とLPS耐性のテスト

Intraperitoneal or oral glucose tolerance tests were performed as follows: 6-h-fasted mice were injected with glucose into the peritoneal cavity (1 g/kg glucose, 20% glucose solution) or by gavage (3 g/kg glucose, 66% glucose solution).
腹腔内もしくは経口グルコース耐性テストを以下のように実施した。

6時間絶食させたマウスの腹膜腔内にグルコースを注射(1キロあたり1グラムのグルコース、20パーセントのグルコース溶液)か、もしくは胃管栄養法で与えた(1キロあたり3グラムのグルコース、66パーセントのグルコース溶液)。

Blood glucose was determined with a glucose meter (Roche Diagnostics) on 3.5 μl blood collected from the tip of the tail vein.
血中グルコースはグルコースメーター(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を使い、尾の静脈の先端から3.5マイクロリットルの血液を採集して決定した。

A total of 20 μl blood was sampled 30 min before and 15 or 30 min after the glucose load to assess plasma insulin concentration.
血漿中のインスリン濃度を評価するため、グルコース負荷の30分前と、15分または30分後に合計20マイクロリットルの血液サンプルを抽出した。

An LPS tolerance test was performed as follows.
LPS耐性テストを以下のように実施した。

Fasted mice were gavaged by LPS (300 μg/kg) diluted in water or corn oil (100 μl) or without LPS.
絶食させたマウスに、水またはコーン油(100マイクロリットル)で希釈したLPS(300マイクログラム/キログラムあたり)か、もしくはLPSを含ませないものを、胃管栄養で与えた。

Blood was collected from the tip of the tail vein before and 30 min after gavage.
尾の静脈の先端から、胃管栄養の前と30分後に血液を採集した。

Plasma was separated and frozen.
血漿は分離して冷凍した。



Microbial enumeration in intestinal content by fluorescent in situ hybridization.
蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、腸の内容物の微生物を列挙する

※fluorescent in situ hybridization (FISH): 蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション。蛍光分子で標識した相補的DNA/RNAを直接ハイブリダイズさせ、組織や微生物のmRNA発現を検出する

※hybridization: ハイブリダイゼーション。互いに相補的な核酸を結合させて、二本鎖の新しい核酸を作ること

The caecal contents collected post mortem from mice were stored at -80°C.
解剖したマウスから盲腸の内容物を採集して、-80℃で保存した。

Samples were thawed on ice and diluted 1:10 in sterile ice-cold 0.1 mol/l PBS, pH 7.0.
サンプルは氷上で解凍して、氷で冷やした0.1モル/リットルの無菌リン酸緩衝食塩液(PBS)で1:10の割合で希釈した (pH 7.0)。

※ice-cold: プロテアーゼなどによるタンパク質の変性を防ぐため氷上で処理する

The suspension was homogenized by pipetting and centrifuged at 3,500g for 15 min to remove particulate matter.
その懸濁液をピペッティングにより均質化してから、微粒子物質を取り除くために3500Gで15分間の遠心分離にかけた。

※homogenize: 均質化する

※g (gravity): 重力加速度

The supernatant containing the bacterial cells was fixed overnight in 4% (wt/vol) paraformaldehyde.
細菌を含む上澄み液を一晩、4パーセント(wt/vol)のパラホルムアルデヒドで固定した。

※wt/vol: 体積あたりの重量

The bacterial cells were then washed and resuspended twice in sterile PBS and finally stored in 50% ethanol in PBS at -20°C until hybridization with appropriate molecular probes targeting specific regions of 16S rRNA.
その後、細菌を洗浄して、2度、無菌PBSに再懸濁した。
最後に、マイナス20℃、50パーセントのエタノールとPBSに保存して、16SリボソームRNAの特異的領域を標的とする適切な分子プローブとハイブリダイゼーションさせた。

The probes used were EREC 482, Bac303, MIB 661, Lab158, Bif164, SRB 687, and probe D specific for the Eubacterium rectale/Clostridium coccoides group, Bacteroides species, mouse intestinal bacteria, Lactobacilli/Enterococci, Bifidobacterium species, sulfate-reducing bacteria, and the Enterobacteriaceae, respectively.
使用したプローブは、EREC 482(ユウバクテリウム属レクターレ/クロストリジウム属コッコイデス)、Bac303(バクテロイデス種)、MIB 661(マウス腸細菌)、Lab158(ラクトバチルス属/エンテロコッカス属)、Bif164(ビフィドバクテリウム属)、SRB 687(硫酸塩還元菌)、プローブD(腸内細菌科)、だった。

The nucleic acid stain DAPI (4″6-diamidino-2-phenylindole) was used for total bacterial counts.
核酸染色のDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を細菌を数える際に使用した。

The DNA probes were tagged with the Cy3 fluorescence dye so that the hybridized samples could be examined using fluorescence microscopy, as described previously (20).
ハイブリダイズされたサンプルを蛍光顕微鏡の研究に使えるように、DNAプローブはCy3蛍光色素で前述のように標識した。

※Cy (cyanine): シアニン

Results were expressed as log10 (bacterial cells per gram caecal content wet weight).
結果は常用対数で表現した (湿重量で盲腸の内容物1グラムあたりの細菌数)。

※log10: 常用対数。10を底とする対数

※wet weight: 湿重量。水分を含んだ状態での重量



Real-time quantitative PCR.
リアルタイム定量PCR

Total RNAs from liver, muscle, and white adipose tissue were prepared using TriPure reagent (Roche, Basel, Switzerland) as described (21).
肝臓、筋肉、白色脂肪組織からの総RNAは、トライピュア試薬(ロシュ社、バーゼル、スイス)を使用して準備した。

PCRs were performed using an ABI PRISM 5700 Sequence Detection System instrument and software (Applied Biosystems, Foster City, CA) as described (21).
PCRはABIプリズム5700配列検出システムの機器とソフト(アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して、前述のように実施した。

Primer sequences for the targeted mouse genes are available upon request (E-mail: patrice.cani@uclouvain.be).
標的となるマウス遺伝子のプライマー配列については、ご要望を承る。



Western blots.
ウェスタンブロット

One hundred milligrams of liver were homogenized in lysis buffer, and the proteins were separated onto a polyacrylamide gel and transferred to polyvinylidine fluoride membrane, as described (17).
前述のように、100ミリグラムの肝臓を溶解バッファーにホモジナイズしたのち、タンパク質をポリアクリルアミドゲル上に分離してから、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。

※homogenize: ホモジナイズ。ホモジネートすること。ホモジネート (homogenate)「細胞を粉砕したもの」

※lysis buffer: 溶解バッファー。細胞を融解させる溶液

※polyvinylidine fluoride (PVDF): ポリフッ化ビニリデン

The membranes were incubated overnight at 4°C with the indicated antibody of nuclear factor κB-p65 (Cell signaling, Saint Quentin Yvelines, France) and inhibitor of κB kinase β-P (Santa Cruz, Le Perray en Yvelines, France).
転写した膜は4℃で一晩、指示した抗体と共にインキュベートした。
抗NF-κB-p65抗体 (セルシグナリング社、サン・カンタン イヴリーヌ、フランス)
抗IκBキナーゼβ-P抗体 (サンタクルス社、ル・ペレ アン イブリーヌ、フランス)

※P (phosphorylated): リン酸化

The binding of the specific primary antibody was quantified as described (17).
抗原特異的な一次抗体の結合は、前述の通りに定量化した。

※primary antibody: 一次抗体。抗原に直接結合した抗体を一次抗体、その抗体に結合したものを二次抗体という
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by travelair4000ext | 2013-03-13 10:51 | 翻訳  

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